Kätevien reaaliaikaisten PCR-koneiden optimointi

Jos kyseessä on reaaliaikainen fluoresenssin kvantitatiivinen PCR viruksen kvantifioinnille ja SNP-genotyypille, tarvitsemme PCR-koneen, jolla on suurin mahdollinen spesifisyys; Jos se on patogeenin ja mRNA: n havaitsemista, tarvitsemme korkean herkkyyden PCR -koneen , joten miten meidän pitäisi optimoida tämä PCR -kone?

Tässä on sisältöluettelo:

l Parantaa PCR -koneen monistustehokkuutta

l Käyttämällä reaaliaikaisia PCR-konekoneita yleiseen PCR: ään

PCR -koneen vahvistustehokkuuden parantaminen

PCR-koneen monistustehokkuuden, spesifisyyden ja herkkyyden parantamiseksi voimme optimoida reaaliaikaisen fluoresenssin kvantitatiivisen PCR-koneen kokeilua varten mittasarjan avulla. Ensimmäinen on kohdesarjan valinta.

1, Valinta kätevä reaaliaikainen PCR-konekonitekvenssi sopiva pituus välillä 50-150 bp. Lyhyempien sekvenssien syntetisoinnin ja lyhyempien monistamisaikojen avulla on vähemmän aikaa, joten saastuttavan DNA: n monistumisen mahdollisuus vähenee.

2, kun valitset kohdesekvenssin, käytä BLAST -hakua analysoidaksesi polymorfismien kohdesekvenssiä ja sekvensointivirheitä ja välttää niitä. Jos kohdesekvenssissä on kaksoiskappaleja, se vähentää tämän PCR -koneen havaitsemisherkkyyttä ja sitä tulisi myös välttää.

3, hallitse GC -pitoisuutta ≤ 60% kohdesekvenssissä. Korkea GC-pitoisuus vaikuttaa kohdesekvenssin denaturointiin lämpösyklissä, mutta myös helppo tuottaa tämä PCR-koneen epäspesifinen monistus.

4, vältä toissijaisen rakenteen luomista. Kohdesekvenssit, joissa on käänteiset toistuvat sekvenssit, on helppo tuottaa sekundaarinen rakenne, mikä vaikuttaa kätevien reaaliaikaisten PCR-konekoneiden ja koettimien hybridisaatioon.

Tämän lisäksi meidän on myös varmistettava, että mallin laatu ei vaikuta monistumiseen, kätevän reaaliaikaisen PCR-koneen tuloksilla on luotettavuus. Esimerkiksi vaurioituneita DNA: ta ei voida monistaa riittävästi PCR -koneessa tai sitä ei ole ollenkaan monisteta. Myös DNA -polymeraasin estävien reagenssien (DMSO jne.) Ja epäpuhtauksien (SDS jne.) Läsnäolo templaatissa voi vaikuttaa PCR -koneen monistustulosten luotettavuuteen.

Reaaliaikaisten PCR-konepohjojen käyttäminen yleiselle PCR: lle

Hanki käteviä reaaliaikaisia PCR-konekoneita , tätä menetelmää voidaan käyttää myös tavalliselle PCR: lle.

1, pituuden tulisi olla 18-30 bp sitoutumisen spesifisyyden varmistamiseksi.

2, sulamislämpötilan (TM-arvo) tulisi olla 55-60 ° C, ja kahden alukkeiden TM-arvojen tulisi eroa 2-3 ° C: ssa.

3, jokaisessa alukkeessa tulisi olla 1-3 guaniinia tai sytosiinia 3'-päässä, mikä voi kätevästi vähentää epäspesifistä monistusta PCR-koneen aikana reaaliajassa. Yli 3 palaa palan ja aiheuttaa 'liukuvaikutuksen ', joka johtaa väärään laajennukseen.

4. Alukkeiden GC -sisällön tulisi olla noin 50%, liian korkea GC -pitoisuus lisää TM -arvoa.

5, PCR -konekonepohjaisten tulisi välttää käänteiset toistuvat sekvenssit, koska se muodostaa toissijaisen rakenteen, joka vaikuttaa templaattin alukkeen sitoutumiseen.

6, jos se on RT-PCR, sinun on myös vältettävä alukkeiden suunnittelusta sitoutumiseen eksonisekvensseihin, mikä johtaa väärien positiivisten PCR-koneiden kokeellisiin tuloksiin. Oikea lähestymistapa tulisi suunnitella pitkään intronin kyljeen tai lyhyisiin introneihin tai eksonin ja exon-risteysalueen yli.

7. Alukkeiden suolanpoisto ja puhdistaminen.

Huomaa, että joskus kun olet tehnyt kaikki seikat, alukkeet eivät välttämättä vahvista, joten sinun tulisi suunnitella alukkeet uudelleen.

Keskittymällä nopeaan nukleiinihappojen havaitsemiseen ja POCT: n nopeaan havaitsemiseen, Bioteke tarjoaa laboratorioinstrumentteja: viruksen näytteenottokokoelma, automaattinen nukleiinihappouuttimen, PCR -kone ja desinfiointilaite. Ja se tarjoaa myös monenlaisia reagensseja ja sarjoja.